用于GPCR和鈣離子通道功能分析的一系列鈣指示劑（三）

今天百螢給大家介紹一下AAT Bioquest除綠色鈣離子熒光探針之外的其他鈣離子熒光探針。除綠色熒光外，AAT Bioquest出售的鈣離子熒光探針還有哪些？它們的性能如何？它們適用于哪些實(shí)驗(yàn)？適用于哪些儀器？一起來(lái)看看吧！

AAT Bioquest出售的其他鈣離子熒光探針

Calbryte -590, AM

Calbryte 590 是對(duì)橙紅色熒光指示劑（例如Calcium Orange 和Rhod-2）的升級(jí)版。該染料在580 nm處具有*大激發(fā)，并被555 nm激光線充分激發(fā)。它的*大發(fā)射波長(zhǎng)為592 nm，與TRITC / Cy3濾光片組兼容。在相同的條件下，Calbryte 590對(duì)鈣的敏感性是Rhod-2的十倍左右。此外，與主要位于線粒體中的Rhod-2不同，Calbryte 590可以很好地保留在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。 

Calbryte-590的產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.與GFP兼容的紅移鈣指示劑
2.Calcium Orange和Rhod-2的上等替代品
3.靈敏度是Rhod-2的十倍
4.與細(xì)胞中的Rhod-2和Cal-590相比，大大提高了信噪比
5.明顯增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)保留
6.細(xì)胞質(zhì)定位

圖1.用Calbryte 590和Rhod-2在不含丙磺舒的情況下，檢測(cè)CHO-K1細(xì)胞中的內(nèi)源性P2Y受體。

Calbryte -630, AM

Calbryte 630 是我們對(duì)紅色和深紅色熒光指示劑（例如X-Rhod-1）的升級(jí)版。這種染料的*大激發(fā)波長(zhǎng)為608 nm，該染料的*大發(fā)射波長(zhǎng)為624 nm，并且與常見(jiàn)的Texas Red濾光片組兼容。由于它與光譜的綠**域相距較遠(yuǎn)，因此Calbryte 630非常適合與綠色熒光標(biāo)記（例如  iFluor 488，  Alexa Fluor 488  或  GFP 復(fù)用。此外，Calbryte 630的長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)使其非常適合研究深部組織。這是因?yàn)檩^長(zhǎng)波長(zhǎng)的染料更容易穿透許多細(xì)胞層，而短波長(zhǎng)的染料則不能。 

Calbryte 630 AM的產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.與GFP兼容的紅移鈣指示劑
2.X-Rhod-1和Cal 630的**替代品
3.明顯增強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)保留
4.非常適合與綠色熒光標(biāo)記（例如iFluor 488，Alexa Fluor 488或GFP）復(fù)用

Rhod-4

Rhod-4是我們針對(duì)Rhod-2的缺點(diǎn)研發(fā)出來(lái)的升級(jí)產(chǎn)品。Rhod-4 除可以激發(fā)514 nm，532 nm和546 nm之外，還可以用488 nm的氬離子激發(fā)光很好地激發(fā)。Rhod-4 的主要特征是細(xì)胞質(zhì)定位，長(zhǎng)多波長(zhǎng)激發(fā)和大于100倍的熒光增強(qiáng)（當(dāng)與鈣形成復(fù)合物時(shí)），使其成為測(cè)量細(xì)胞鈣的理想指標(biāo)，尤其是當(dāng)化合物具有強(qiáng)熒光時(shí)并且應(yīng)用程序需要GFP。我們的Rhod-4 AM在細(xì)胞中的亮度比Rhod-2 AM高4倍以上。這一特性使Rhod-4 對(duì)于HTS應(yīng)用的效果更好。

Rhod-4產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 細(xì)胞質(zhì)定位：Rhod-4 AM主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，而Rhod-2 AM主要定位在線粒體中。
2. 多種激發(fā)選項(xiàng)：?490 nm，514 nm，532 nm和546 nm;
3. 更高的熒光強(qiáng)度：比Rhod-2 AM好10倍；
4. 更高熒光信號(hào)：在Ex 530 nm / Em 570 nm處，比Rhod-2 AM亮度高4倍。 

圖3.使用Screen Quest Rhod-4 NW分析試劑盒和Rhod-2 AM在HEK-293細(xì)胞中測(cè)定了卡巴膽堿劑量反應(yīng)。 將HEK-293細(xì)胞以40,000個(gè)細(xì)胞/ 100 μL /孔在Costar黑色96孔板中過(guò)夜接種。 使用Screen Quest Rhod-4 NW鈣測(cè)定試劑盒或100 μL Rhod-2 AM溶液（5 μM）在室溫下將細(xì)胞與100 μL染料上載溶液孵育1小時(shí)。 NOVOstar（BMG Labtech）添加了卡巴膽堿（25μL /孔）以達(dá)到*終指示的濃度。 使用Rhod-4 NW的卡巴膽堿的EC50約為0.6 μM。

圖4.使用Rhod-4 AM（Cat＃21120）和Rhod-2 AM（Cat＃21064）在CHO-K1細(xì)胞中測(cè)量了ATP刺激的內(nèi)源性P2Y受體鈣反應(yīng)。 將CHO-K1細(xì)胞以50,000個(gè)細(xì)胞/ 100 μL /孔在Costar 黑色96孔板中過(guò)夜接種。 除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并用Rhod-4 AM（4 μM，A和B）或Rhod-2 AM（4 μM，C和D）將100 μL染料加載溶液在室溫下孵育細(xì)胞1小時(shí)。 用200 μL HHBS代替染色液，然后在ATP處理之前（A和C）和之后（B和D）使用TRITC通道通過(guò)熒光顯微鏡（Olympus IX71）對(duì)細(xì)胞成像。

Cal Red R525 / 650 AM

Cal Red R525 / 650是一種用于新型的488 nm可激發(fā)比例的熒光鈣指示劑。當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞前，Cal Red R525 / 650的熒光很弱，一旦進(jìn)入細(xì)胞，親脂性AM阻斷基團(tuán)就會(huì)被細(xì)胞內(nèi)酯酶裂解，導(dǎo)致帶負(fù)電荷的熒光染料很好地保留在細(xì)胞中，激發(fā)波長(zhǎng)接近488 nm，并且在525 nm和650 nm處有兩次發(fā)射。當(dāng)用生物活性化合物刺激細(xì)胞時(shí)，該受體會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放，該鈣被Cal Red R525 / 650螯合。當(dāng)在488 nm激發(fā)時(shí)，發(fā)射信號(hào)在525 nm處增加，在650 nm處降低。Cal Red R525 / 650的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)與普通濾光片組兼容，對(duì)細(xì)胞的損害*小，使其成為評(píng)估和篩選GPCR激動(dòng)劑和拮抗劑以及鈣通道靶標(biāo)的強(qiáng)大工具。

Fura-8 , AM/Fura-10 , AM

AAT Bioquest研發(fā)的Fura-8 ，為了進(jìn)一步改善Fura-2的鈣離子反應(yīng)時(shí)出現(xiàn)的一些缺陷。Fura-8的發(fā)射光線移到了更長(zhǎng)的可見(jiàn)光波長(zhǎng)，與普通濾光片兼容。它具有與Fura-2相當(dāng)?shù)拟}親和力。與Fura-2 AM相比，F(xiàn)ura-8 AM對(duì)鈣的敏感性更高，信號(hào)/背景比更高。Fura-10 , AM，的研發(fā)是為了讓熒光信號(hào)更好的保留在細(xì)胞內(nèi)，是Fura-8的升級(jí)產(chǎn)品，在沒(méi)有丙磺舒的情況下，F(xiàn)ura 10表現(xiàn)出信號(hào)/背景比的比Fura-8要強(qiáng)上許多。

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